Phân Tích Hàm Lượng Nitơ Bằng Phương Pháp Kjeldahl: Giai Đoạn Phá Mẫu

Mặc dù một số kỹ thuật phân tích cho phép xác định trực tiếp các loài mà không cần xử lý mẫu, nhưng thông thường cần phải hòa tan mẫu trước khi phân tích. Hầu hết các phân tích được ưu tiên thực hiện trên các mẫu dung dịch, do đó thu được mẫu phân tích đồng nhất hơn về các đặc tính khối của một mẫu rắn lớn, cải thiện độ đúng và độ chính xác.

Phá mẫu trong quy trình Kjeldahl có thể được định nghĩa là quá trình trong đó một chất phức tạp bị phân hủy thành các khí dễ bay hơi và các muối đơn giản hòa tan trong dung dịch axit loãng. Phân hủy ướt hoặc phân hủy bằng axit liên quan đến việc sử dụng axit khoáng, một mình hoặc kết hợp với các axit và tác nhân oxy hóa khác, để thực hiện quá trình hòa tan mẫu. Phá mẫu vẫn là một yếu tố hạn chế trong kiểm soát thực phẩm. Nó tốn nhiều thời gian và dựa trên nhiều kiến thức thực nghiệm.

Quy trình xử lý mẫu của phương pháp Kjeldahl

Phương pháp Kjeldahl là một quá trình oxy hóa ướt sử dụng axit sulfuric đậm đặc. Ban đầu, chỉ sử dụng axit sunfuric, nhưng do quá trình oxy hóa trong các điều kiện như vậy tốn nhiều thời gian, đặc biệt nếu sử dụng các mẫu lớn, nên phương pháp này đã sớm được sửa đổi bằng cách bổ sung kali sunfat. Với ưu điểm là nhiệt độ sôi cao hơn, quá trình oxy hóa có thể diễn ra trong thời gian ngắn hơn nhiều.

Quartaroli cho rằng quá trình phá mẫu diễn ra theo hai bước: oxy hóa chất hữu cơ và khử toàn bộ nitơ thành muối amoni. Từ các thí nghiệm của mình với các hợp chất tinh khiết, ông đã kết luận rằng khi hoạt động oxy hóa yếu và chậm, hoạt động tăng tốc của pha oxy hóa là nhẹ. Các chất oxy hóa mạnh có hại cho giai đoạn khử, dẫn đến mất nitơ. Pyrolusite dạng bột được khuyến nghị là tác nhân oxy hóa hữu ích nhất.

Wicks và Firminger không khuyến khích sử dụng axit perchloric, vì tổn thất lớn do sử dụng lượng dư axit không quá rõ ràng với phương pháp vĩ mô. Nó là một tác nhân oxy hóa cực mạnh và phải thận trọng khi sử dụng, đặc biệt là sự mất nitơ thông qua sự hình thành và phân hủy sau đó của amoni perclorat hoặc quá trình oxy hóa amoni sulfat thành nitơ. Pepkowitz và cộng sự đã thu được kết quả tốt khi thêm 10 giọt HClO₄ sau khi đun nóng mạnh mẫu trong H₂SO₄ đậm đặc và để nguội trước khi thêm.

Hydrogen peroxide cũng được sử dụng thường xuyên trong cả phép phân tích nitơ Kjeldahl vi mô và vĩ mô như một tác nhân oxy hóa, đồng thời người thực hiện thuận lợi trong việc sử dụng H₂O₂. Marquee và Allista phát hiện ra rằng việc sử dụng kali pyrosulfate kết hợp với hydro peroxide sẽ tạo ra quá trình oxy hóa nhanh chóng.

Rõ ràng là bằng cách tăng độ khắt nghiệt của phản ứng, quá trình oxy hóa sẽ được tăng tốc. Bỏ qua tác dụng của chất xúc tác, điều này được thực hiện bằng cách sử dụng các tác nhân oxy hóa và bằng cách tăng hàm lượng muối, từ đó làm tăng điểm sôi. Ưu điểm của việc tăng lượng kali sulfat được sử dụng, ngoài việc rút ngắn thời gian phân hủy, là trong nhiều trường hợp, các kết quả lý thuyết thu được không thể thực hiện được khi sử dụng 10 gam kali sulfat thông thường. Điều này đã được xác nhận bởi các người vận hành khác nhau.

Sử Dụng Permanganate Làm Chất Oxy Hoá?

Các chất oxy hóa (hydro peroxide, axit perchloric, persulfate, axit cromic) có thể được thêm vào axit sulfuric để tăng tốc và hoàn thành bước phân hủy, đồng thời giảm thiểu sự tạo bọt. Tuy nhiên, dường như có rất ít lợi thế trong việc sử dụng các axit hoặc chất oxy hóa khác kết hợp với axit sulfuric để vô cơ hoá mẫu trong phương pháp Kjeldahl.

Axit photphoric có nhược điểm là ăn mòn bình phân hủy, trong khi axit pecloric là chất oxy hóa mạnh cực kỳ nguy hiểm. Hỗn hợp axit sunfuric/axit photphoric đã được sử dụng trong quy trình bán vi mô Kjeldahl. Có những thử nghiệm sử dụng hỗn hợp H₂SO₄-HClO₄ để phân tích Kjeldahl hóa chất nông nghiệp và nguyên liệu thực vật, hoặc kali dicromat; tuy nhiên các phương pháp này vẫn chưa được áp dụng rộng rãi.

Một số tác nhân oxy hóa khác (V₂O₅, CrO₃, MnO₂) đã được sử dụng, nhưng chúng dường như không có bất kỳ tác dụng có lợi nào và thậm chí còn có hại khi được thêm vào với số lượng lớn. Phương pháp ban đầu của Kjeldahl đã thêm thuốc tím để oxy hóa hoàn toàn mẫu. Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc tím đã gây ra nhiều tranh cãi và không được khuyến nghị. Nó có xu hướng gây ra kết quả thấp, có thể do oxy hóa amoniac, trừ khi lượng sử dụng rất vừa phải.

Người ta đã chỉ ra rằng nếu permanganat được thêm vào trước khi quá trình phân hủy hoàn tất thì sẽ thu được kết quả thấp. Một phương pháp bán vi lượng đối với nitơ trong than đá và các vật liệu cacbon khác đã được mô tả. Đối với nhiều loại chất (ngũ cốc, thức ăn chăn nuôi, than, alkaloid), thuốc tím được thêm dần dần vào dịch phân hủy axit nóng có ưu điểm so với chất xúc tác thông thường được sử dụng trong phương pháp Kjeldahl trên cả bán vi mô và vi mô. Kỹ thuật phá mẫu permanganat này phù hợp để phân tích thông thường vật liệu lá cà phê.

Ảnh Hưởng Của Axit và Muối Lên Quá Trình Vô Cơ Hoá Mẫu

Axit sunfuric đặc, nóng đóng vai trò là chất oxi hóa yếu. Cacbon của chất hữu cơ nên được oxy hóa mà không oxy hóa amoniac thành khí nitơ. Phạm vi oxy hóa-khử để nitơ bị khử thành amoniac là một phạm vi hẹp. Điều này có thể giải thích sự mất nitơ đôi khi xảy ra khi có các nhóm oxy hóa hoặc halogen trong một hợp chất. Quá trình hóa than thường diễn ra trong axit nóng và cacbon đóng vai trò là chất khử. Các dạng nitơ bị oxy hóa chỉ bị khử một phần trong các điều kiện này và thường được xử lý sơ bộ bằng chất khử thích hợp.

Một yếu tố khác cần tính đến là nhiệt độ, luôn phải đủ cao để gây ra và đảm bảo sự phân hủy nhiệt phân của mẫu. Kali sulfat đã được sử dụng để nâng cao điểm sôi của axit sunfuric và tăng khả năng oxy hóa của hỗn hợp phân hủy, và đã được chứng minh là loại muối hiệu quả nhất để sử dụng vì khả năng hòa tan cao trong axit sunfuric. Hàm lượng axit và muối nhằm tạo nhiệt độ phân hủy khoảng 380◦C.

Nếu mẫu chứa một lượng rất lớn muối hoặc chất rắn vô cơ hòa tan trong quá trình phân hủy, nhiệt độ có thể tăng lên trên 400◦C, và có thể mất nitơ do nhiệt phân. Lượng kali sulfat tối đa có thể được sử dụng mà không làm đông đặc khối phân hủy khi làm mát là 10 g trên 25 mL axit sunfuric.

Tổng lượng axit cần thiết sẽ khác nhau tùy thuộc vào kích thước của mẫu, khả năng dễ phân hủy, tốc độ gia nhiệt, tổng thời gian phân hủy và việc thêm các hợp chất khác cũng như thời gian đun sôi. Lượng amoniac hình thành chủ yếu phụ thuộc vào thời gian phân huỷ; nếu thời gian đủ dài, gần như tất cả các hợp chất chứa nitơ sẽ phân huỷ hoàn toàn. Tỷ lệ axit/muối ban đầu thường trong khoảng từ 1,4 – 2,0. Đối với các mẫu có mức tiêu thụ axit cao (mẫu có hàm lượng chất béo cao…), tỷ lệ muối axit ban đầu có thể khoảng 2,5 – 2,8.

Nhiệt Độ Của Quá Trình

Quá trình phân hủy ở nhiệt độ cao đảm bảo thu hồi các hợp chất nitơ không bị phân hủy ở điểm sôi của axit sunfuric đậm đặc và giảm đáng kể thời gian cần thiết để phân hủy hoàn toàn mẫu. Phạm vi nhiệt độ 360 – 410◦C là tối ưu cho phương pháp này. Bằng cách chọn nhiệt độ thích hợp để phân hủy nhanh và thu hồi hoàn toàn nitơ ngay cả từ các hợp chất bền nhiệt (như tryptophan, lysine hoặc axit nicotinic,…) thậm chí hầu hết là nitro và hợp chất azo mà không cần tiền xử lý khử.

Quá trình phân hủy có thể xảy ra rất nhanh khi chọn cẩn thận chất xúc tác, do đó quá trình chuyển đổi thành amoni bisulfat được tăng tốc, nhưng nhiệt độ được chọn không gây ra sự thất thoát nitơ do nhiệt phân. Việc dùng H₂SO₄ trong quá trình oxy hóa có thể xảy ra ở mức độ làm tăng đáng kể nhiệt độ do tăng tỷ lệ K₂SO₄/H₂SO₄. Quá trình oxy hóa sơ bộ với chất oxy hóa phụ, như hydro peroxit, có thể được yêu cầu để giải quyết vấn đề này, nhằm thực hiện quá trình oxy hóa nhanh chất béo và cacbohydrat và do đó tránh tiêu thụ quá nhiều axit sulfuric.

Xúc Tác Cho Quá Trình Phân Huỷ Mẫu

Do quá trình phân hủy ban đầu của mẫu diễn ra chậm nên nhiều chất xúc tác đã được đề xuất để tăng tốc quá trình phân hủy mẫu. Thủy ngân được cho là chất xúc tác hiệu quả nhất và nó được sử dụng phổ biến trong phòng thí nghiệm thông thường. Tuy nhiên, nó rất độc hại và tốn kém khi sử dụng, đồng thời quá trình chưng cất NH₃ bằng cách thêm kiềm sẽ không hoàn thành khi thủy ngân làm chất xúc tác, do thủy ngân tạo thành phức kết tủa với amoniac; natri sunfua, natri thiosunfat hoặc bụi kẽm phải được thêm vào để phân hủy phức chất thủy ngân.

Selenium có giá trị đáng kể như một chất xúc tác, mặc dù nó là chủ đề của một số tranh cãi, tạo ra nhiều báo cáo về kết quả thất thường, phục hồi không hoàn toàn hoặc mất nitơ. Ngoài ra, selen cũng gây nguy hiểm cho sức khỏe. Một chất xúc tác hỗn hợp selen-thủy ngân có thể được điều chế bằng kali sunfat, thủy ngân sunfat và bột selen. Để rút ngắn thời gian cần thiết cho quá trình phân hủy trong bình Kjeldahl, hỗn hợp thuốc thử selen (Na₂SO₄, Hg₂SO₄, CuSO₄, Se) thường được sử dụng.

Đồng đã được đề cập như một chất xúc tác thay thế trong các ấn bản đầu tiên của Phương pháp phân tích chính thức và dự kiến, và việc sử dụng đồng sunfat để định lượng nitơ trong sữa đã được đề xuất lần đầu tiên bởi Rowland. Việc thay thế thủy ngân bằng đồng làm chất xúc tác cũng đã được đề xuất. Đồng sunfat đã được thay thế cho thủy ngân làm chất xúc tác trong phương pháp Tiêu chuẩn 20A:1986 của Liên đoàn Sữa Quốc tế (IDF) để xác định hàm lượng nitơ trong sữa.

Phương pháp Kjeldahl để phân tích nitơ trong thịt và các sản phẩm từ thịt sử dụng chất xúc tác đồng đã được AOAC Quốc tế áp dụng. Chất xúc tác hỗn hợp Na₂SO₄-CuSO₄ đã được sử dụng trong quá trình phân hủy mô thực vật để phân tích chất dinh dưỡng đa lượng. Mặc dù chất xúc tác đồng thể hiện độ lệch âm khi so sánh với chất xúc tác thủy ngân, nhưng cường độ của nó nhỏ hơn độ lệch chuẩn tái tạo của các phương pháp. Việc sử dụng chất xúc tác Pd(II)-Cu(II) cho phép phân hủy các hợp chất bền nhiệt như pyridin thành amoniac.

Zirconium dioxide được phát hiện là có tiềm năng xúc tác cho phép xác định tổng nitơ Kjeldahl. Vật liệu vi tinh thể màu trắng dễ dàng hòa tan trong axit sunfuric, không độc hại và có giá hợp lý, với tỷ lệ chi phí 20:1 nghiêng về zirconium dioxide so với oxit thủy ngân. Độ lặp lại, độ biến thiên giữa các phòng thí nghiệm và độ biến thiên so với Kjeldahl thủ công bằng hoặc tốt hơn khi sử dụng chất xúc tác gốc antimon (0,8g kali antimonat hemihydrat, 0,16g kẽm sulfat heptahydrat, 0,02g cupric sulfat pentahydrat và 49g kali sulfat) so với chất xúc tác thủy ngân.

Phá Mẫu Hoàn Toàn Bằng Hydrogen Peroxide

Hydrogen peroxide đã được chứng minh là một chất oxy hóa nhanh và mạnh các chất hữu cơ và đã được sử dụng thành công trong quá trình phá mẫu Kjeldahl để phân hủy các mẫu hữu cơ. Kleemann đã bổ sung hydro peroxide vào mẫu, sau đó phân hủy bằng axit sunfuric và kali sunfat để thu được sự chuyển đổi nhanh chóng nitơ thành amoniac. Koch và McMeekin cacbon hóa mẫu trong axit sunfuric và sau đó thêm từng giọt hydro peroxide bằng cách đun nóng để thu được quá trình oxy hóa nhanh với khả năng giữ lại hoàn toàn nitơ dưới dạng amoniac.

Một nghiên cứu cẩn thận về việc sử dụng peroxit đã chứng minh tầm quan trọng của quá trình cacbon hóa trước và nhiều lần bổ sung để thu hồi toàn bộ nitơ. Các phương pháp hydro peroxit bằng axit sunfuric ở dạng ban đầu cũng như ở dạng biến tính bằng cách xử lý sơ bộ các mẫu bằng axit salicylic và natri thiosulfat đã được áp dụng để đảm bảo thu hồi hoàn toàn nitrat-N.

Tuy nhiên, Nelson và Sommers thu được tổng số N thu hồi kém (84%) từ nguyên liệu thực vật bằng cách sử dụng quy trình phân hủy axit sulfuric-hydro peroxide, không có kali sulfat hoặc chất xúc tác. Xử lý bằng hydro peroxide dẫn đến tạo bọt quá nhiều và làm mất mẫu từ các ống phân hủy. Florence và Milner báo cáo sự cần thiết phải làm nóng hỗn hợp phân hủy sau khi làm trong để thu hồi nitơ đầy đủ. Quy trình này thích hợp hơn so với quy trình sử dụng chất xúc tác có độc tính cao.

Xử lý nguyên liệu thực vật bằng hỗn hợp H₂O₂-H₂SO₄ khi không có chất xúc tác kim loại đã được đề xuất như một quy trình phân hủy thay thế để xác định nitrat-nitơ trong thực vật. Nhiều nguyên tố khác cũng có thể được xác định trong phân hủy peroxy được chuẩn bị mà không có chất xúc tác thủy ngân hoặc kim loại khác, như phốt pho, kali, canxi, sắt và đồng. Dung dịch hỗn hợp hydro peroxide và axit sulfuric đậm đặc gần đây đã được sử dụng để phá mẫu để phân tích protein, thời gian phá mẫu được giảm đáng kể.

Công ty CP Thiết Bị Khoa học H2TECH – Là đơn vị cung cấp các thiết bị khoa học kỹ thuật hàng đầu tại Việt Nam. H2TECH là đối tác của nhiều trường học các viện nghiên cứu và các trung tâm thí nghiệm. Là một trong những nhà phân phối tại Việt Nam, với nhiều hãng nỗi tiếng khác nhau trên thế giới như BEGER, HANON, J.P SELECTA, HINOTEK…. Nếu bạn đang có nhu cầu về các loại thiết bị phá mẫu cho quy trình Kjeldahl hoặc thiết bị phòng thí nghiệm khác hãy liên hệ với H2TECH để được hỗ trợ cung cấp các thiết bị với mức giá hợp lý nhất.

CÔNG TY CP THIẾT BỊ KHOA HỌC H2TECH
Chuyên cung cấp các thiết bị phòng thí nghiệm – Thiết kế phòng lab
Chúng tôi hợp tác lâu dài dựa trên uy tín, chất lượng và hỗ trợ cho khách hàng một cách tốt nhất
Hotline: 0934.07.54.59
    028.2228.3019
Email: thietbi@h2tech.com.vn
       salesadmin@h2tech.com.vn
Website: https://h2tech.com.vn
https://thietbihoasinh.vn 
https://thietbikhoahoch2tech.com